隨著熒光檢測的普及，許多研究人員正考慮將western blot的檢測方法從化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)到多重?zé)晒?。這一趨勢背后有多個(gè)推動(dòng)力。zui重要的是，熒光檢測能夠?qū)崿F(xiàn)多重western blot分析，每次能夠同時(shí)檢測幾個(gè)目標(biāo)蛋白，而不再需要?jiǎng)冸x和重新雜交。熒光的其他好處在于動(dòng)態(tài)范圍更寬、信號(hào)穩(wěn)定性更好。

隨著熒光檢測的普及，許多研究人員正考慮將western blot的檢測方法從化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)到多重?zé)晒狻＿@一趨勢背后有多個(gè)推動(dòng)力。zui重要的是，熒光檢測能夠?qū)崿F(xiàn)多重western blot分析，每次能夠同時(shí)檢測幾個(gè)目標(biāo)蛋白，而不再需要?jiǎng)冸x和重新雜交。熒光的其他好處在于動(dòng)態(tài)范圍更寬、信號(hào)穩(wěn)定性更好。

為了讓這個(gè)轉(zhuǎn)換過程更加輕松，Bio-Rad的科學(xué)家為我們帶來了一些熒光western blot的小貼士。
 

• 抗體濃度應(yīng)當(dāng)優(yōu)化，在幾種不同稀釋度的抗體中孵育膜。選擇信噪比zui高的稀釋度。
• 從化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)到熒光檢測時(shí)，一抗?jié)舛葢?yīng)當(dāng)增加；通常來說是增加2-5倍。二抗?jié)舛瓤赡芤残枰獌?yōu)化；1:5,000稀釋是個(gè)不錯(cuò)的起點(diǎn)。在使用特定抗體時(shí)，可以參照生產(chǎn)商的建議。生物通 • 為了讓信噪比zui高，應(yīng)使用自發(fā)熒光低的膜，如 Immun-Blot® low fluorescence （LF） PVDF membrane。
• 許多封閉液都成功用于熒光檢測。我們建議使用0.5-5% 酪蛋白、zui多5%的脫脂奶粉，或zui多3% BSA，溶于TTBS中。• 緩沖液中的顆粒可能停留在膜上，并造成熒光假象。只使用高質(zhì)量的試劑，并對(duì)所有緩沖液過濾滅菌。
• 使用鈍的鑷子從邊緣操作。避免劃破膜或弄皺，這會(huì)在熒光檢測時(shí)造成假象。生物通 • 使用鉛筆來標(biāo)記膜，因?yàn)樵S多墨水都會(huì)發(fā)出熒光。
• 溴酚藍(lán)會(huì)發(fā)出熒光。確保染料與樣品已分開，切掉凝膠上包含染料的部分，或省掉樣品緩沖液中的溴酚藍(lán)。• 無需在暗處開展免疫檢測；正常的室內(nèi)燈光不會(huì)使熒光標(biāo)記的抗體發(fā)生光漂白。不過，熒光標(biāo)記抗體的儲(chǔ)液應(yīng)保存在暗處。
• 在處理膜時(shí)，使用無粉末的手套，以避免膜上出現(xiàn)假象或指紋。

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